Poslední rozhovor se světově respektovaným biochemikem Emilem Palečkem

Prof. Paleček jako první na světě položil základ pro současný rozvoj elektrochemie DNA a RNA, nabízející čipy pro stanovení nukleotidových sekvencí i poškození DNA. Po řadu desetiletí patřil ke světové špičce v oblasti elektrochemie DNA a výrazně přispěl k pokroku v oblasti chemické reaktivity DNA a ve výzkumu jejích lokálních struktur. Za svoji práci v této oblasti získal roku 2014 cenu Česká hlava, nejvyšší české vědecké vyznamenání. Přečtěte si rozhovor, který jsme s ním vedli na sklonku letošního léta.

Začátky vaší práce jsou spojeny s polarografickou metodou; v čem spočívala?

Polarografie je elektrochemická metoda, kterou navrhl Jaroslav Heyrovský v roce 1922 a v roce 1959 za svůj objev dostal Nobelovu cenu. Já jsem principy, které on objevil, použil k něčemu, co nikdo jiný nedělal, a mnozí, kteří se v elektrochemii vyznali, mě za to silně kritizovali. Začal jsem totiž pomocí této metody analyzovat DNA. Zajímavé bylo, že klasická polarografie Heyrovského nefungovala, protože byla málo citlivá. A tak jsem použil metodu, kterou jsme jako diplomanti měli k dispozici, takzvanou oscilografickou polarografii.

Jak se liší?

Oscilografickou polarografii objevil Heyrovský v roce 1941. Od původní polarografické metody se značně lišila, jednak měřila křivky oscilograficky, tedy na oscilografu, a nejdůležitější na této metodě bylo, že se při ní elektroda polarizovala nikoliv napětím, což platí v klasické polarografii, ale proudem. Vkládali jsme proud na elektrodu a v souvislosti s tím se měnil potenciál elektrody – mohli jsme tedy měřit závislost potenciálu na čase.

Co všechno můžete s pomocí polarografie změřit?

Polarograficky se měří roztoky a ta polarografická metoda ve své době byla něco velice zajímavého, protože to byla první instrumentální metoda, která umožňovala zjistit složení daného roztoku. Bylo s ní možné určit, že jsou v roztoku například kovové ionty, a nejen které tam jsou, ale také kolik jich tam je. Ve své době to bylo skvělá metoda, dnes je samozřejmě celá řada jiných a dokonalejších způsobů.

Jakým způsobem jste tuto metodu využil vy?

Snažil jsem se polarografii použít k analýze DNA, a ono to nešlo. Takže jsem místo toho použil oscilografickou polarografii, která se na analýzu DNA velmi dobře hodila. V roce 1957 jsem byl ještě student, tenkrát se tomu říkalo aspirant, dneska říkáme Ph.D. student. V tom roce vyšla práce, kterou napsal Hermann Berg, Němec, který uvedl, že zkusil pomocí oscilografické polarografie analyzovat DNA, a jeho závěr byl, že DNA je inaktivní, že neposkytuje žádný redukční ani oxidační signál.

Tedy říkal, že ta metoda nefunguje?

Ano, jenomže já už jsem měl výsledky, které ukazovaly, že to tak není. On měl smůlu, protože si zvolil jedno z mála prostředí, ve kterém to nefungovalo. Když jsem potom v roce 1958 publikoval svoji práci, všichni lidé říkali, no jo, to je nějaký hloupý student, vždyť přece Berg ukázal, že to nejde, a teď tu nějaký Čech něco předvádí. Takže jsem byl v obtížné situaci a zastal se mě až profesor J. Heyrovský, který si uvědomoval význam výzkumu DNA. Ten mě stimuloval v mé práci a poskytl mi potřebnou podporu. Moji další práci mi pak uveřejnili v prestižním časopise Nature. 

Co jste pomocí oscilografické polarografie zjistil?

Zjistil jsem, že jednořetězcové báze DNA (tedy písmenka v genetické abecedě) poskytují redukční i oxidační signály a že redukční signály neposkytuje dvouřetězcová DNA, ve které jsou báze nedostupné, protože jsou ukryty uvnitř dvoušroubovicové struktury. Mohl jsem tedy snadno rozlišit jednořetězcovou od dvoušroubovicové DNA.

Jak se tento objev dal využít?

Od r. 1953 se vědělo, že DNA má dvoušroubovicovou strukturu a že se její řetězce mohou rozdělit – tomu procesu se říká denaturace. Vědci si lámali hlavu, jak by je mohli zase zpátky spojit, a nešlo jim to. Až na Harvard University se objevil v laboratoři Paula Dotyho profesor Julius Marmur, který přišel na to, jak to udělat. Proces, při kterém se oba řetězce spojily, byl nazván renaturace DNA. V té době potřeboval profesor Marmur nějaké metody, kterými by mohl celý proces sledovat, nějaké sice byly k dispozici, ale on jich potřeboval víc. Přečetl si můj článek v Nature a pozval mě, abych s ním v jeho laboratoři spolupracoval. 

Používá se polarografie ještě dnes?

Základní princip je stejný, zlepšila se zejména technologie. Pokrok je obrovský, všechny metody jsou vylepšené a ani my jsme ten starý přístroj od roku 1966 už nepoužívali. Začali jsme používat jinou metodu, takzvanou pulzní polarografii. V polovině 60. let jsme neměli devizové prostředky na zakoupení pulzního polarografu. Shodou okolností však byl v roce 1965 na brněnském veletrhu pulzní polarograf vystavován. Přišel jsem si jej prohlédnout a ten, kdo přístroj vystavoval, byl shodou okolností také chemik a viděl moje nadšení. Podařilo se mi ho přesvědčit, že bychom ty přístroje mohli využít, a tak jsme na tom veletrhu od rána do večera měřili. Celý proces bylo nutno provádět v dusíkové atmosféře, a tak mi laborantka nosila dusík v duši fotbalového míče.

Jak se vaše metoda liší od sekvenování DNA?

V 60. letech panovalo přesvědčení, že DNA nikdy nepůjde sekvenovat, že je moc veliká. Dařilo se sekvenovat RNA, ale s DNA to zatím nešlo. Další objevy, například enzymy, které dokážou v určitých místech pokrájet tu DNA, přišly až později a umožnily sekvenaci DNA, která byl velmi pracná a nepříliš vhodná pro sekvenci celých genomů. Teprve v 90. letech se začalo uvažovat o sekvenaci genomové. Jeden z principů sekvenace DNA je založen na tom, že když znáte sekvenci jednoho řetězce, tak znáte automaticky sekvenci i toho druhého, protože vždycky naproti písmenku G musí být C a naproti A musí být T. Odborně to nazýváme principem komplementarity. Sekvenování bylo založeno na optických metodách, ale my jsme ukázali, že to jde i elektrochemickými metodami. Dnes už ale elektrochemie nemůže konkurovat, protože metoda sekvenování, říká se jí next generation sequencing, už ji dalece překonala.

Kam jste se od oscilografické polarografie posunuli?

Dlouho jsme pracovali s nukleovými kyselinami, zabývali jsme se dál elektrochemickými metodami, superhelikálním vinutím v DNA a teď aktuálně pracujeme na výzkumu glykoproteinů, který by mohl umožnit například z krve zjišťovat informace o zdravotním stavu pacienta. Metody, se kterými pracujeme, využívají komplexy osmia. V současné době využíváme především komplexy šestimocného osmia. A je zajímavé, že zatímco ty osmimocné se vážou na pyrimidinové báze DNA, tak ty šestimocné se vážou na cukry. A vážou se na RNA, protože na konci jejího řetězce je cukr – ribóza, která je dostupná pro naše činidlo a umožní nám tak ji modifikovat.

Co vám to umožnilo?

Když jsme viděli, že se takto modifikují cukry v RNA, tak jsme si řekli, proč to nezkusit také na něčem jiném. Začali jsme pracovat s polysacharidy, oligosacharidy a glykoproteiny. Osmium detekujeme především pomocí elektrochemických metod. A to je to, co teď převážně děláme. Kromě toho se také ještě trochu zabýváme elektrochemií DNA.

Jakým způsobem?

Ukazujeme, že můžeme DNA nebo RNA stanovit ve velmi nízkých koncentracích bez jakéhokoliv značení. Obě navíc během svých změn vylučují vodík, takže další krok by mohl být sledování toho vodíku, ale jestli to půjde, nebo nepůjde, to ještě nevíme. Každopádně už dnes můžeme o několik řádů zvýšit citlivost té analýzy. 

Jakým způsobem je možné uplatnit vaše poznatky v medicíně?

Spolupracujeme s onkologií, kde jsme se zapojili do práce na nádorovém supresoru proteinu p53. To je protein, který má tu vlastnost, že dává pozor, aby člověk nedostal rakovinu. A dělá to velice mazaně – když dojde k mutaci DNA, vždycky existuje nebezpečí, že ta mutace by mohla vyvolat vznik rakoviny. Ne každá, ale některá to prostě dělá. Ten protein je schopen rozpoznat, že k mutaci došlo, a spustí dva možné procesy: jeden zastaví buněčné dělení na určitý čas a za tu dobu organismus dokáže opravit poškozenou DNA a druhý mechanismus je ten, že vyvolá apoptózu, což je programovaná smrt buňky. Buňka s mutací zahyne a žádná rakovina nevznikne.

Co se stane, když zmutuje samotný protein?

Když p53 zmutuje, přestane potlačovat vznik rakoviny, a dokonce začne u některého typu mutací škodit. Podařilo se nám navrhnout elektrochemickou metodu analýzy proteinů, kterou jsme aplikovali na protein p53. 

Potýkali jste se při hledání vhodné metody s nějakými potížemi?

Když jsem byl malý, tak si vzpomínám, že byly žehličky na dřevěné uhlí. To bylo ještě za války. A na našem dvoře si paní nachystaly žehličku, pak ji vzaly a točily s ní, aby se uhlí rozhořelo. Pak na spodek té žehličky vždycky prstem kleply, a buď točily dál, nebo řekly „je to dobré“ a šly žehlit. Pozoruhodné se mi zdálo to, že se nikdy žádná nespálila. No a na tom jsme založili tu naši metodu. Ještě před nějakými deseti roky se totiž věřilo, že když se bílkovina adsorbuje na kovovou elektrodu, tak se prostě zdenaturuje.

„Zdenaturuje“ znamená, že se rozpadne?

To není přesné. Představte si to jako dům, který se během zemětřesení sesype. Úplně se nerozpadne, ale ta struktura je pryč. Podobně je to v našem případě – když je ta bílkovina, kterou zkoumáme, na povrchu, jenž je negativně nabitý, tak se takhle sesype. My jsme použili takovou technologii, kterou nikdo předtím nepoužil a která nám umožňuje ten čas, po který ta bílkovina je na elektrodě, zkrátit na milisekundy, a díky tomu můžeme zkoumat změny ve struktuře bílkovin, jak jsem již uvedl, tedy například při analýze proteinu p53, kde jsme dokázali rozlišit mutantní proteiny od těch standardních.

Jaké jsou vaše nejnovější objevy?

V 80. letech minulého století jsme navrhli chemické sondy struktury DNA, založené na komplexech osmimocného osmia, umožňující analýzu struktury DNA nejen ve zkumavkách, ale i přímo v buňkách. Nyní se snažíme používat komplexy šestimocného osmia pro analýzu cukrů a glykoproteinů. Glykoprotein je bílkovina, která má na sobě navázánu cukernou složku. A ukazuje se, že glykosylace bílkoviny, tedy obsah a struktura cukru v bílkovině, má velice zajímavý vztah ke zdraví a nemoci. Řada biomarkerů jsou glykoproteiny. A takový příklad glykoproteinu je třeba PSA – což je biomarker na rakovinu prostaty. Bohužel tento biomarker je velmi málo specifický.

Co to znamená?

Může se stát, že máte zvýšenou hodnotu, a přitom nemáte rakovinu. A když se necháte operovat, aniž byste se přesvědčil, zda tu rakovinu skutečně máte, tak je to pak hrozné, že ano. A naopak můžete mít velmi dobré hodnoty a ve skutečnosti rakovinu mít. V Americe a v Anglii už proto tuto metodu nepoužívají. U nás se pořád používá, protože přece jenom ve většině případů jsou její výsledky správné.

Dokážete toto měření zpřesnit?

Momentálně se měří hladina PSA v krvi. Když se kromě toho změří ještě složení toho cukru, tak ta specificita najednou ohromně vyletí. Ale problém je ten, že zjistit změnu struktury toho cukru je velmi obtížné, a zatím to dokážeme jedině metodami, které se naprosto nehodí pro klinickou medicínu. Jsou pracné, drahé a pokrok je velice malý. Co se nám podařilo v loňském roce, což je ale jen dílčí úspěch, je právě modifikace cukrů obsažených v PSA šestimocným osmiem. Ukázalo se totiž, že díky tomu od sebe krásně rozpoznáme izomery, které jsou typické pro rakovinu prostaty, od těch, které jsou obsaženy v PSA zdravých mužů.

Co by tato metoda mohla do budoucna umožnit?

Kdyby to fungovalo tak, jak předpokládáme, umožnilo by to rychlou, jednoduchou a levnou diagnostiku. 

A to by člověk potom došel k doktorovi, nechal si odebrat krev a lékař by z ní zjistil vše, co by potřeboval?

Doktor ne, ale laboratoř ano. Ovšem může to dopadnout i tak, že se to nepovede. Zatím pracujeme jen s krátkými částmi izomerů cukrů obsažených v lidském organizmu. Práci provádíme v malém týmu s finanční podporou vedení našeho Biofyzikálního ústavu AV ČR v Brně, v naději, že v příštím roce snad získáme podporu od grantové agentury.